靶向肿瘤的微环境响应性和厚朴酚前药设计、合成及其活性研究

熊姝馨，黄超**

（重庆大学药学院，重庆 401331）

2.02.02.02.02.02.0College of Pharmacy, Chongqing University, Chongqing 401331；College of Pharmacy, Chongqing University, Chongqing 401331重庆大学药学院，重庆 401331;重庆大学药学院，重庆 401331401331;40133113797865121;1662332338913797865121;16623323389重庆市沙坪坝区重庆大学虎溪校区;重庆市沙坪坝区重庆大学虎溪校区xiongshuxin200001@163.com;chuang@cqu.edu.cn熊姝馨（2000-），女，硕士，药物化学;黄超（1986）,男，副教授，硕导，药剂学/药物化学熊姝馨;黄超XIONG shuxin;HUANG chao黄超 2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.01*|*期刊*|*Zhang W, Mao J H, Zhu W, Jain A K, Liu K, Brown J B. Karpen, G. H. Centromere and kinetochore gene misexpression predicts cancer patient survival and response to radiotherapy and chemotherapy [J]. Nature communications, 2016, 7: 12619.<CR>2*|*期刊*|*Kim E S, Neubauer M, Cohn A, Schwartzberg L, Garbo L, Caton J, R. Docetaxel or pemetrexed with or without cetuximab in recurrent or progressive non-small-cell lung cancer after platinum-based therapy: a phase 3, open-label, randomised trial [J]. The Lancet Oncology 2013, 14 (13): 1326-36.<CR>3*|*期刊*|*Luo H, Vong C T, Chen H, et al. Naturally occurring anti-cancer compounds: shining from Chinese herbal medicine [J]. Chinese Medicine, 2019, 14(1): 48-50.<CR>4*|*期刊*|*Ong C P, Lee W L, Tang Y Q. Honokiol: a review of its anticancer potential and mechanisms [J]. Cancers, 2019, 12(1): 48.<CR>5*|*期刊*|*Hua H, Chen W, Shen L, Sheng Q, Teng L. Honokiol augments the anti-cancer effects of oxaliplatin in colon cancer cells [J]. Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 2013, 45(9): 773-9.<CR>6*|*期刊*|*Lin D, Yan Z, Chen A, Ye J, Hu A, Liu J, Peng J, Wu X. Anti-proliferative activity and structure-activity relationship of honokiol derivatives [J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2019, 27(16): 3729-3734.<CR>7*|*期刊*|*Shi X, Zhang T, Lou H, Song H, Li C, Fan P. Anticancer effects of honokiol via mitochondrial dysfunction are strongly enhanced by the mitochondria-targeting carrier berberine [J]. Journal of Medicinal Chemistry, 2020, 63(20): 11786-11800.<CR>8*|*期刊*|*Prasher P, Fatima R, Sharma M, et al. Honokiol and its analogues as anticancer compounds: Current mechanistic insights and structure-activity relationship [J]. Chemico-Biological Interactions, 2023, 386: 110747.<CR>9*|*期刊*|*Chen S, Zhao X, Chen J. Mechanism-based tumor-targeting drug delivery system, validation of efficient vitamin receptor-mediated endocytosis and drug release [J]. Bioconjugate Chemistry, 2010, 21(5): 979-987.<CR>10*|*期刊*|*Russell-Jones G, McTavish K, McEwan J, et al. Vitamin-mediated targeting as a potential mechanism to increase drug uptake by tumours [J]. Journal of Inorganic Biochemistry, 2004, 98(10): 1625-33.<CR>11*|*期刊*|*Ding Z, Wang S, Shi Y, Fei X, Cheng B, Lu Y, Chen J. Discovery of novel d-(+)-biotin-conjugated resorcinol dibenzyl ether-based PD-L1 inhibitors for targeted cancer immunotherapy [J]. Journal of Medicinal Chemistry, 2023, 66(15): 10364-10380.<CR>12*|*期刊*|*Gupta A, Pandey A. K, Mondal T, Bhattacharya J, Sasmal P. K. Multifunctional iridium(III)-platinum(IV) conjugates as potent anticancer theranostic agents [J]. Journal of Medicinal Chemistry, 2023, 66(13): 8687-8704.<CR>13*|*期刊*|*Liu L, Liu F, Liu D, Yuan W, Zhang M, Wei P, Yi T. A smart theranostic prodrug system activated by reactive oxygen species for regional chemotherapy of metastatic cancer [J]. Angewandte Chemie, 2022, 61(12): 110472.靶向肿瘤的微环境响应性和厚朴酚前药设计、合成及其活性研究|Targeting the tumor microenvironment responsiveness honokiol prodrugs design, synthesis and its active research||1|熊姝馨|XIONG shuxin|重庆大学药学院，重庆 401331|College of Pharmacy, Chongqing University, Chongqing 401331|熊姝馨（2000-），女，硕士，药物化学|重庆市沙坪坝区重庆大学虎溪校区|401331|xiongshuxin200001@163.com|13797865121|13797865121<CR>*|2|黄超|HUANG chao|重庆大学药学院，重庆 401331|College of Pharmacy, Chongqing University, Chongqing 401331|黄超（1986）,男，副教授，硕导，药剂学/药物化学|重庆市沙坪坝区重庆大学虎溪校区|401331|chuang@cqu.edu.cn|16623323389|16623323389

摘要：和厚朴酚是从厚朴的根和茎皮分离来的天然活性成分，具有抗感染、抗肿瘤、抗氧化等药理作用，其中抗癌活性通过多种机制共同调控。然而，和厚朴酚的口服生物利用度低，选择性差，限制了其临床应用。为此，我们通过具有GSH响应性的二硫键将和厚朴酚与生物素靶向基团进行偶联，设计合成了一系列前药，该前药借助生物素的靶向作用到达肿瘤位点，与癌细胞的表面受体特异性结合，通过内吞作用进入癌细胞，二硫键被胞内高浓度GSH断裂，释放出原药，发挥抗肿瘤作用。体外活性测试发现，前药表现出与原药相当的活性，但可以有效降低对生物素受体低表达细胞的损伤；GSH响应性实验结果表明，肿瘤细胞内高浓度GSH的确能够断裂二硫键，顺利释放出和厚朴酚，实现原药在胞内的高浓度蓄积。研究结果表明，生物素-和厚朴酚前药策略对于提高药物安全性和原药的靶向蓄积具有显著效果，进一步开展基于该策略的和厚朴酚前药抗肿瘤活性筛选，有望发现更多对其他肿瘤细胞有抑制作用的活性化合物。

关键词：药物化学；抗肿瘤；和厚朴酚；生物素

中图分类号：R

Targeting the tumor microenvironment responsiveness honokiol prodrugs design, synthesis and its active research

XIONG shuxin, HUANG chao

(College of Pharmacy, Chongqing University, Chongqing 401331)

Abstract: Honokiol, a natural active compound extracted from the roots and stem bark of Magnolia officinalis, exhibits anti-infection, anti-tumor, and antioxidant pharmacological properties. Among 25 these, its anticancer effects are particularly notable, regulated through various mechanisms. However, honokiol's clinical utility is hampered by its low oral bioavailability and poor selectivity. Addressing these limitations, we have designed and synthesized a series of prodrugs that link honokiol to biotin targeting groups via a glutathione (GSH)-responsive disulfide bond. These prodrugs leverage the targeting capability of biotin to home in on the tumor site, specifically bind to the surface receptors of cancer cells, and enter these cells through endocytosis. Once inside, the high intracellular GSH concentration breaks the disulfide bond, releasing the active drug to exert its anticancer effects. In vitro studies demonstrate that these prodrugs maintain activity comparable to the parent compound while reducing harm to cells with lower biotin receptor expression. GSH response experiments confirm that the elevated GSH levels in tumor cells efficiently cleave the disulfide bond, facilitating smooth honokiol release, achieving high concentration of the active drug in the cell. These findings suggest that the biotin-conjugated honokiol prodrugs strategies have significant effects on improving drug safety and targeted accumulation of the active drug, and further screening of the anti-tumor activity of honokiol prodrugs based on this strategy is expected to find more active compounds that have inhibitory effects on other tumor cells.

Key words: Medicinal chemistry; Antitumor; Honokiol; Biotin

引言

癌症其居高不下的发病率和死亡率，严重威胁着人类的生命健康，常规的癌症治疗对人体具有较大的毒副作用，并且往往伴随巨大经济负担和较差的预后结果[1-2]。从天然植物中寻找并开发毒副作用小且更加安全有效的抗癌化合物一直是研究热点之一。随着我国中药学的发展，已有大量天然中草药用于临床辅助治疗癌症患者，研究人员从中草药中分离得到天然活性产物，之后将这些活性产物进行适当的结构改造，从而开发出活性高、特异性强、毒副作用小的天然抗癌药物[3]。

从药用植物厚朴中可提取出一种天然联苯类化合物和厚朴酚(Honokiol, HK)，其来源广泛且价格低廉，具有抗感染、抗焦虑、抗氧化等药理作用。己有文献报道和厚朴酚可诱导一些肿瘤细胞株的凋亡，对多种肿瘤细胞具有细胞毒性，而且对人体毒副作用小，广泛应用于抗肿瘤药物的研究[4-7]。但和厚朴酚的水溶性比较差，导致其生物利用率低，并且缺乏特异性，这些问题严重阻碍了其开发应用[8]。因此，设计合成和厚朴酚衍生物，提高对肿瘤细胞的靶向性并且增强治疗效果对于癌症临床治疗是至关重要的。在肿瘤细胞表面存在一系列与肿瘤细胞生长增殖密切相关的受体，这类受体在肿瘤组织过度表达，而在正常细胞表面通常不表达或极少表达。生物素(Biotin)受体就是其中之一[9]，它在白血病、卵巢癌、结肠癌、肺癌和乳腺等癌细胞表面均过度表达[10]。近年来，由于生物素相对简单的化学结构、低分子量和较高的肿瘤特异性，以生物素为配体的小分子-药物偶联物受到越来越多的关注[11-13]。研究发现将抗肿瘤药物与生物素偶联后，药物对癌细胞的细胞毒性和选择性都将有所提高。

本研究计划分别合成带有巯基的生物素片段和带有巯基吡啶的和厚朴酚片段，再通过二硫键连接两个片段，最终得到Bio-HK小分子前药。由于该化合物连接了靶向基团，可以一定程度上解决和厚朴酚选择性差的问题，提高药物对癌细胞的选择性并降低毒副作用。

实验部分

实验试剂与仪器

实验仪器：恒温磁力搅拌器、RV-10DS96旋转蒸发仪、DLSB-5/30 ℃低温冷却水循环泵、SHZ-D循环水式真空泵、ME204E 电子天平、ZF7暗箱三用紫外分析仪、85-1磁力搅拌器、Agilent核磁共振波谱仪400 MHz、SolariX傅里叶变换离子回旋共振质谱仪（高分辨质谱）等。所有化合物的氢谱和碳谱均由核磁处理软件MestReNova处理。谱图中的化学位移(δ)表示信号位置，化学位移单位为(ppm)，耦合常数用J表示，单位为Hz。图谱峰型标注为：s = singlet，d = doublet，t = triplet，q = quartet，m = multiplet。氘代溶剂均为Camgride Isotope Lab产品且都以TMS作为内标。高分辨质谱均由SolariX傅里叶变换离子回旋共振质谱仪（高分辨质谱）测定。

实验试剂：实验过程中使用到的二氯甲烷、甲醇、乙腈等溶剂均为分析纯，购买于成都科隆化学品有限公司，可直接使用。实验中所需的其它化学试剂均购买于安耐吉、阿拉丁、希恩斯和阿达玛等公司。

前药的合成

和厚朴酚片段的保护

称取和厚朴酚1(5.30 g, 20 mmol, 2.0 equiv.)加入250 mL反应瓶中，量取60 mL二氯甲烷(CH2Cl2)，待和厚朴酚完全搅拌溶解后，将N,N-二异丙基乙胺(DIPEA, 1.55 g, 12 mmol, 1.2 equiv.)缓慢滴加到反应体系中，再将三乙基氯硅烷(TES-Cl, 1.51 g, 10 mmol, 1.0 equiv.)溶于30 mL乙酸乙酯(EtOAc)并置于恒压滴液漏斗，调节漏斗低速滴加，通过TLC监测反应过程，常温搅拌12 h，旋干反应液，粗品经硅胶柱层析(PE:EtOAc = 100:1)，获得无色透明油状化合物2a(2.41 g, 63%)，2b(0.68 g, 18%)。

化合物5a的合成

将二硫二吡啶3(6.60 g，30.0 mmol，1.0 equiv.)和巯基乙醇4a(1.95 g，25.0 mmol，1.2 equiv.)溶解在50 mL甲醇中，然后在室温下搅拌4 h，TLC监测原料消耗完全之后，直接用旋转蒸发仪去除溶剂，粗品经过柱层析(PE:EtOAc = 3:1)后得到化合物5a(4.48 g，80%)其为浅黄色油状液体。

化合物7的合成

在氮气保护下，吸取化合物5a(1.21 g, 6.4 mmol, 1.0 equiv.)加入到100 mL圆底烧瓶中，用30 mL CH2Cl2溶解，在搅拌过程直接加入对硝基苯基氯甲酸酯6(1.54 g, 7.7 mmol, 1.2 equiv.)和Et3N(1.31 g, 7.5 mmol, 2.0 equiv.)，常温反应8 h，期间采用TLC检测，反应结束后，加入20 mL1N盐酸萃取，然后饱和食盐水洗涤有机相，收集、干燥并浓缩有机相，不经过柱层析直接进行下一步反应。

化合物8a和8b的合成

在50 mL反应瓶中加入化合物7(0.81 g, 2.1 mmol, 1.0 equiv.)，化合物2a(0.90 g, 2.6 mmol, 1.2 equiv.)和4-二甲氨基吡啶(DMAP, 0.29 g, 1.2 mmol, 0.5 equiv.)，加入20 mL CH2Cl2溶解，室温搅拌反应6 h，TLC监测原料消耗完全之后，直接用旋转蒸发仪去除溶剂，然后粗品经过柱层析(PE:EtOAc = 50:1-30:1)后得到化合物8a(1.01 g，85%)为浅黄色油状液体。

化合物8b的合成参考8a的合成方法，经柱层析(PE:EtOAc = 50:1-30:1)后得到化合物8b(0.95 g，80%)，为浅黄色油状液体。

化合物9a和9b的合成

化合物8a (0.7 g, 1.2 mmol, 1.0 equiv.)用10 mL四氢呋喃(THF)溶解后，在搅拌下滴加冰乙酸(0.1 g, 2.4 mmol, 2.0 equiv.)，然后加入四丁基氟化铵(TBAF, 0.76 g, 2.4 mmol, 2.0 equiv.)，常温反应2小时，反应期间采用TLC对反应进行监测，TES脱除完全后，直接用旋转蒸发仪除去溶剂，然后加入10 mL×3乙酸乙酯和水进行萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤有机相，加入无水硫酸钠干燥，最后在真空下进行浓缩，获得白色固体化合物9a，不经过柱层析纯化，立马直接进行下一步反应。

化合物9b的合成参考9a的合成方法，9b为白色固体。

化合物10的合成

称取巯基乙醇4a(0.5 g, 6.40 mmol, 1.0 equiv.)和三苯基氯甲烷(Trt-Cl, 2.1 g, 7.68 mmol, 1.2 equiv.)，置于圆底烧瓶中，加入20 mL干燥的THF，常温下反应12 h。反应结束后，去除溶剂，柱层析分离(PE: EtOAc = 10:1)，收集得到白色固体状目标产物10(1.4 g，产率为67%)。

化合物12的合成

在氮气保护下，将生物素11(Biotin, 0.50 g, 2.1 mmol, 1.0 equiv.)和化合物10(0.79 g, 2.5 mmol, 1.2 equiv.)溶解在20 mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，将反应体系冷却至0 ℃，再快速加入二环己基碳二亚胺(DCC, 0.63 g, 3.08 mmol, 1.5 equiv.)和DMAP(0.03 g, 0.21 mmol, 0.1 equiv.)，加料完毕后，将反应置于常温下搅拌过夜，TLC检测反应过程，磷钼酸溶液显色。反应结束后，先用油泵通过冷阱连接旋转蒸发仪旋干N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，旋干后加入硅胶拌样，经柱层析分离纯化(CH2Cl2:MeOH = 50:1)。收集得到白色粉末状化合物12(0.31 g，27.3%)。

化合物13、16的合成

将化合物12(0.31 g, 0.55 mmol)溶解在10 mL CH2Cl2中，依次加入0.8 mL三氟乙酸(TFA)和0.3 mL三乙基硅烷(Et3SiH)，TLC监测，待原料中Trt脱除后，旋走溶剂，向其加入10 mL碳酸氢钠水溶液，然后用CH2Cl2 (3×10 mL)萃取，合并有机相，在用饱和食盐水洗涤有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩去除溶剂，得到粗品13。

化合物16的合成参考13的方法。

化合物14的合成

将巯基乙胺4b(1.3 g, 5 mmol, 1.0 equiv.)和三苯基甲醇(0.63 g, 5.6 mmol, 1.1 equiv.)溶解于10 mLTFA中，室温搅拌4 h，反应结束后旋走TFA，加入10 mL EtOAc，然后碳酸氢钠水溶液(3×10 mL)萃取，饱和食盐水洗涤有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，在真空下浓缩去除溶剂，得到粗品，然后经柱层析(CH2Cl2:MeOH = 20:1)得到白色固体粉末14(0.4 g, 95%)。

化合物15的合成

在氮气保护下，将生物素(0.30 g, 1.2 mmol, 1.1 equiv.)溶解在10 mL干燥DMF中，室温下加入DIPEA(0.27 g, 2.1 mmol, 2.0 equiv.)和HATU(0.52 g, 1.4 mmol, 1.3 equiv.)，最后加入化合物14(0.33 g, 1.1 mmol, 1.0 equiv.)，在室温下搅拌过夜，TLC监测反应结束后，先用油泵通过冷阱连接旋转蒸发仪旋干DMF，然后加入20 mL水，用CH2Cl2(3×10 mL)萃取，加入20 ml饱和食盐水洗涤有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，在真空下进行浓缩，得到的粗品经柱层析(CH2Cl2:MeOH = 50:1)收集白色固体粉末15(0.38 g, 64.4%)。

前药的合成

将化合物9a(0.30 g, 0.6 mmol, 1.0 equiv.)和化合物13(0.20 g, 0.6 mmol, 1.0 equiv.)溶解于10 mL甲醇中，在氮气保护下，室温搅拌过夜，待反应结束后，溶剂用真空旋转蒸发仪去除，得到的粗品加硅胶拌样，经柱层析(CH2Cl2:MeOH = 30:1)纯化，得到白色粉末状化合物17a(Bio-HK1, 0.24 g, 60%)。

用通用合成方法合成前药17b（Bio-HK2, 0.30 g，65%），其为白色粉末。

用通用合成方法合成前药18a（Bio-HK3, 0.41 g，70%），其为白色粉末。

用通用合成方法合成前药18b（Bio-HK4, 0.37 g，68%），其为白色粉末。

体外细胞毒性研究

体外细胞毒性测定

细胞毒性实验是检测药物体外活性最基本的实验。噻唑蓝(MTT)，是一种黄色染料，能够与活细胞中的成分反应，形成不溶于水的甲瓒紫色结晶，可用来检测细胞的存活情况。在本章实验中，我们选取A549、Hela、MCF-7、MDA-MB-231和L02来检测化合物的细胞毒性。

实验步骤：取对数生长期细胞铺于96孔板中，每孔细胞个数约为2000个，待细胞生长至70%左右，吸出每个孔中的废液并用PBS清洗一次，用DMSO溶解配置母液，DMEM稀释制成不同浓度梯度的药物（DMSO体积不得超过总体积的1‰），将配制好的溶液按浓度梯度加入每个孔，每个浓度药物有3个平行组，空白组中加入相应体积的DMSO溶液，继续培养48 h后，在每个孔中加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL)，再继续孵育4 h，吸去孔中废液，每个孔加入100 μL的DMSO，震板使孔内紫色结晶物充分溶解，最后用酶标仪检测在各孔在490 nm处的吸光度，数据用Excel处理后再用GraphPad Prism 6 计算IC50。

GSH响应性释放

高效液相色谱条件的建立

色谱柱：ODS-AQ2546(4.6×250mm, 5μm)；检测波长：258 nm；柱温：37 ℃；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL；流动相A：甲醇，流动相C：纯水，序列运行期间梯度洗脱，流动相的梯度变化如表1所示：

表1 Bio 1-4前药的HPLC分析方法

Tab. 1 HPLC analysis method of Bio 1-4 prodrugs

Time/min	Mobile phase A/%	Mobile phase C/%
0	50	50
10	100	5

后运行5 min。

标准曲线的建立

首先，精密称取和厚朴酚和化合物各2.00 mg至1 mL容量瓶，加入甲醇溶液定容至刻度线，即得母液。精密吸取母液用甲醇溶液分别稀释得到0.01、0.02、0.03、0.05、0.10 mg/mL的溶液，过尼龙注射器滤膜(0.45 μm)，按“1.4.1”所述的HPLC色谱条件检测，记录测定结果，并通过曲线下峰面积对和厚朴酚和前药的浓度绘制标准曲线，通过回归方程确定其线性关系。

GSH响应释放的探究

配制含有2.0 mM GSH的PBS缓冲溶液，将化合物稀释成0.1 mM溶液，置于37 ℃水浴锅恒温孵育4 h后，过尼龙注射器滤膜(0.45 um)。通过HPLC测定体外释放液中的药物含量。计算药物释放度，并绘制药物释放曲线，进行3次平行实验。使用甲醇和水作为流动相，按表1所述的HPLC色谱条件检测，记录测定结果。

实验结果与讨论

化合物表征数据

2a，1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.24 – 7.13 (m, 2H), 7.08 – 6.99 (m, 2H), 6.90 – 6.87 (m, 2H), 6.05 – 5.89 (m, 2H), 5.15 – 5.02 (m, 4H), 3.41 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 3.34 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 1.03 (t, J = 7.9 Hz, 9H), 0.81 (q, J = 7.9 Hz, 6H).

2b，1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.32 – 7.25 (m, 2H), 7.09 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.97 (dd, J = 8.2, 2.4 Hz, 1H), 6.82 (t, J = 9.4, 8.2 Hz, 2H), 6.09 – 5.93 (m, 2H), 5.19 – 5.01 (m, 4H), 3.45 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 3.35 (d, J = 6.7 Hz, 2H), 0.84 (t, J = 7.9 Hz, 9H), 0.54 (q, J = 7.8 Hz, 6H).

5a，1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.50 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 7.60 – 7.40 (m, 1H), 7.39 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.15 (dd, J = 6.8, 5.5 Hz, 1H), 3.80 (t, J = 4.0 Hz, 2H), 2.95 (t, J = 4.0 Hz, 2H).

8a，1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.45 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 7.67 – 7.53 (m, 2H), 7.24 – 7.02 (m,，6H), 6.81 (d, J = 8.3 Hz, 1H),6.02 - 5.88 (m, 2H), 5.19 – 4.95 (m, 4H), 4.29 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 3.39 (dd, J = 12.4, 6.8 Hz, 4H), 2.93 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 1.01 (t, J = 7.9 Hz, 9H), 0.79 (q, J = 7.9 Hz, 6H). 13C NMR (101 MHz, Chloroform-d) δ 159.50, 153.16, 153.07, 149.69, 146.27, 138.44, 137.01, 136.96, 136.84, 134.25, 130.94, 130.62, 130.45, 129.67, 128.04, 127.61, 122.01, 120.85, 119.81, 118.07, 116.18, 115.52, 65.85, 39.62, 36.90, 34.57, 6.71, 5.34.

8b，1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.50 (d, J = 4 Hz 1H), 7.75 – 7.61 (m, 2H), 7.44 – 7.35 (m, 2H), 7.19 – 7.07 (m, 3H), 7.02 (dd, J = 8.2, 2.3 Hz, 1H), 6.83 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.03 - 5.87 (m, 2H), 5.15 – 5.01 (m, 4H), 4.52 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.37 (dd, J = 10.7, 6.7 Hz, 4H), 3.15 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 0.83 (t, J = 7.9 Hz, 9H), 0.55 (q, J = 7.9 Hz, 6H). 13C NMR (101 MHz, Chloroform-d) δ 159.38, 153.28, 150.81, 149.79, 148.04, 137.65, 137.43, 137.06, 135.72, 132.97, 131.90, 131.70, 130.89, 130.76, 128.64, 128.50, 121.19, 120.95, 119.96, 119.90, 116.28, 115.60, 66.04, 39.43, 36.99, 34.55, 6.53, 4.97.

10，1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.42 – 7.39 (m, J = 7.5 Hz, 6H), 7.28 – 7.26 (m, 2H), 7.26 – 7.21(m, J = 4.7 Hz, 3H), 7.19 – 7.17 (m, J = 7.5 Hz, 4H), 3.36 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 2.46 (t, J = 6.2 Hz, 2H). 13C NMR (101 MHz, Chloroform-d) δ 144.89, 129.71, 128.07, 126.89, 66.68, 61.00, 35.38.

12，1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.42 – 7.40 (m, J = 7.8 Hz, 6H), 7.31 – 7.29 (m, J = 7.4 Hz, 3H), 7.27 – 7.26 (m, J = 2.9 Hz, 3H), 7.24 – 7.20 (m, J = 7.2 Hz, 3H), 5.36 (s, 1H), 4.93 (s, 1H), 4.45 (t, J = 7.8, 5.0 Hz, 1H), 4.26 (t, J = 7.8, 4.6 Hz, 1H), 3.87 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.12 (q, J = 11.3, 5.8 Hz, 1H), 2.87 (dd, J = 12.9, 4.9 Hz, 1H), 2.70 (d, J = 12.8 Hz, 1H), 2.47 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.29 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.73 – 1.59 (m, J = 14.6, 5.7 Hz, 6H), 1.47 – 1.38 (m, J = 15.6, 7.4 Hz, 2H). 13C NMR (101 MHz, Chloroform-d) δ 173.25, 163.51, 144.53, 129.53, 127.94, 126.77, 66.83, 62.69, 61.88, 60.05, 55.42, 40.53, 33.71, 30.90, 28.27, 28.18, 24.70.

14，1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.43 – 7.41 (m, 6H), 7.29 – 7.25 (m, 6H), 7.22 – 7.20 (m, 3H), 3.45 (s, 2H), 2.57 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.33 (t, J = 6.5 Hz, 2H). 13C NMR (101 MHz, Chloroform-d) δ 145.00, 129.72, 128.00, 126.79, 66.73, 41.07, 36.13.

15，1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.38 – 7.36 (m, 6H), 7.28 – 7.24 (m, 6H), 7.21 – 7.17 (m, 3H), 6.66 (s, 1H), 6.36 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.34 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 4.2 (m, J = 8.0 Hz, 1H), 3.09 – 3.03 (m, 3H), 2.77 (dd, J = 12.8, 4.8 Hz, 1H), 2.59 (d, J = 12.8 Hz, 1H), 2.42 (q, J = 4.0 Hz, 2H), 2.12 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 1.74 – 1.55 (m, 4H), 1.41 - 1.33 (m, 2H). 13C NMR (101 MHz, Chloroform-d) δ 173.22, 164.08, 144.62, 129.51, 127.95, 126.80, 66.77, 61.71, 60.17, 55.59, 40.46, 38.24, 35.89, 32.13, 28.17, 28.04, 25.58.

17a，1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.24 – 7.01 (m, 5H), 6.89 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.09 – 5.92 (m, 2H), 5.81 (s, 1H), 5.14 – 5.08 (m, 4H), 4.50 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 4.34 – 4.27 (m, 5H), 3.42 (t, J = 6.3 Hz, 4H), 3.15 (q, J = 8.0 Hz, 1H), 2.94 – 2.83 (m, 3H), 2.82 – 2.70 (m, 3H), 2.39 – 2.34 (m, 2H), 1.76 – 1.62 (m, 4H), 1.50 – 1.41 (m, 2H). 13C NMR (101 MHz, Chloroform-d) δ 173.87, 163.83, 154.41, 153.38, 146.47, 138.68, 137.13, 136.85, 134.54, 131.11, 130.86, 128.98, 128.15, 126.32, 122.13, 116.37, 116.06, 115.64, 66.28, 62.22, 62.12, 60.38, 55.50, 40.63, 39.79, 37.51, 37.04, 34.76, 33.77, 28.19, 24.81. HRMS (ESI):m/z calculated for C33H40N2NaO7S3+ [M+Na]+ : 695.1890, found: 695.1897.

17b，1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.43 – 7.34 (m, 2H), 7.17 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.05 – 6.97 (m, 2H), 6.87 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 5.94 – 5.83 (m, 2H), 5.60 (s, 1H), 5.19 – 4.98 (m, 4H), 4.49 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 4.32 (t, J = 6.4 Hz, 3H),4.17 – 4.15 (m, 1H), 3.35 (dd, J = 24.0, 6.7 Hz, 4H), 3.09 – 3.03 (m, 1H), 3.01 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.94 (t, J = 6.4 Hz, 2H),2.80 – 2.75 (m, 1H), 2.61 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 2.30 (t, J = 7.8 Hz, 2H),1.67 - 1.54 (m, 4H), 1.45 - 1.33 (m, 2H). 13C NMR (101 MHz, Chloroform-d) δ 173.46, 163.90, 153.47, 151.44, 148.30, 137.77, 136.57, 135.53, 132.04, 131.84, 131.29, 130.43, 129.04, 128.50, 127.26, 121.95, 116.62, 116.22, 115.54, 66.29, 62.08, 61.98, 60.14, 55.37, 40.43, 39.35, 37.46, 37.04, 34.51, 33.77, 28.32, 28.10, 24.67. HRMS (ESI):m/z calculated for C33H40N2NaO7S3+ [M+Na]+ : 695.1890, found: 695.1891.

18a，1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.66 (s, 1H), 7.18 – 7.05 (m, 4H), 6.95 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.74 (s, 1H), 6.07 – 5.91 (m, 2H), 5.11 – 5.02 (m, 4H), 4.42 (t, J = 4.0 Hz, 1H), 4.25 (t, J = 6.5 Hz, 3H), 3.46 (q, J = 6.2 Hz, 2H), 3.39 (t, J = 6.0 Hz, 4H), 3.08 (q, J = 6.6 Hz, 1H), 2.86 – 2.79 (m, 1H), 2.73 (t, J = 4.0 Hz, 2H), 2.69 – 2.64 (m, 3H), 2.20 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.74 – 1.56 (m, 4H), 1.43 – 1.35 (m, 2H). 13C NMR (101 MHz, Chloroform-d) δ 174.29, 164.41, 154.48, 153.24, 146.29, 138.59, 136.94, 136.79, 134.43, 130.87, 130.57, 128.36, 127.97, 127.72, 126.64, 121.91, 116.26, 115.72, 115.41, 66.22, 61.87, 60.31, 55.72, 40.53, 39.61, 38.33, 37.76, 36.46, 35.83, 34.39, 28.20, 28.02, 25.60. HRMS (ESI):m/z calculated for C33H41N3NaO6S3+ [M+Na]+ : 694.2050, found: 694.2061.

18b，1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.47 – 7.35 (m, 2H), 7.15 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.05 – 6.97 (m, 2H), 6.89 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.65 (s, 1H), 6.43 (s, 1H), 5.99 – 5.85 (m, 2H), 5.61 (s, 1H), 5.18 – 4.93 (m, 4H), 4.50 (q, J = 5.6 Hz, 2H), 4.31 (t, J = 6.1 Hz, 1H), 4.12 (t, J = 4.4 Hz, 1H), 3.53 (q, J = 4.0 Hz, 2H), 3.35 (dd, J = 22.4, 6.7 Hz, 4H), 3.03 – 2.97 (m, 3H), 2.83 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 2.76 (dd, J = 8.0, 4.8 Hz, 1H), 2.61 (d, J = 12.8 Hz, 1H), 2.11 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.65 – 1.53(m, 4H), 1.35 – 1.30(m, 2H). 13C NMR (101 MHz, Chloroform-d) δ 173.92, 164.15, 153.68, 151.60, 148.22, 137.77, 136.75, 135.54, 131.91, 131.78, 131.33, 130.43, 129.03, 128.56, 127.26, 121.82, 116.61, 116.27, 115.53, 66.44, 61.80, 60.22, 55.53, 40.42, 39.35, 38.29, 38.14, 36.68, 35.78, 34.51, 28.13, 27.92, 25.51. HRMS (ESI):m/z calculated for C33H41N3NaO6S3+ [M+Na]+ : 694.2050, found: 694.2056.

体外细胞毒性研究

本实验通过MTT法分别考察了各前药对不同肿瘤细胞的毒性作用，同时以HK作为对照，表1为IC50值的总结，根据实验结果显示，在这4个目标化合物中，前药在生物素受体表达较多的肿瘤细胞(A549、MCF-7、Hela)上表现出与HK相当的体外细胞毒性，但是减少了对生物素受体表达较少的L02和MDA-MB-231细胞损伤，说明引入生物素基团能提高和厚朴酚的安全性。

表1 HK和前药在不同细胞上的抗增殖活性

Tab. 1 Antiproliferative activity of HK and prodrug on different cancer or normal cells

Comp.	IC50 (µM)
A549	MCF-7	Hela	MDA-MB-231	L02
Bio-HK1	49.1	35.95	29.14	56.12	45.44
Bio-HK2	48.6	39.6	32.78	59.26	50.59
Bio-HK3	47.8	42.02	38.10	60.6	55.7
Bio-HK4	49.4	39.79	33.85	65.03	54.54
HK	34.6	31.5	35.92	40.56	23.08

GSH响应性释放

研究表明，肿瘤细胞内的GSH浓度能达到5~10 mmol远高于正常组织细胞，为了进一步探讨前药的GSH响应性释放效率，我们测试了在2.0 mM GSH环境中，4种前药分子的释放情况。结果如图1所示：Bio-HK1~4可以在高浓度GSH存在下断裂二硫键释放出药物分子HK，4 h后释放率分别达到33%，34%，44%和39%。

图1 前药释放

Fig. 1 Prodrug release

结果与展望

本文以生物素为靶向配体，和厚朴酚为活性抗癌药物，用含二硫键的连接臂合成了4个Bio-HK前药，并研究了其抗肿瘤活性和GSH响应性释放效率。体外细胞毒性结果表明，前药保持与HK相当的抗肿瘤活性，并且减少了对正常细胞的损伤。GSH响应性释放结果表明，在高浓度GSH下，前药的二硫键断裂释放出原药HK从而发挥抗肿瘤活性。综上所述，通过引入生物素靶向基团可以实现和厚朴酚对肿瘤细胞的特异性靶向，可为基于和厚朴酚的新型抗肿瘤药物研发提供基础研究。

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作者简介：熊姝馨（2000-），女，硕士，药物化学

通信联系人：黄超（1986）,男，副教授，硕导，药剂学/药物化学. E-mail: chuang@cqu.edu.cn